Viene progettato un RNA guida (gRNA), simile a un crRNA, mirato a una regione del gene e l’enzima Cas9 è in grado di causare rotture a doppio filamento in questa regione specifica del genoma della cellula ospite (Figura 1). Dopo che è stata creata una rottura a doppio filamento, la cellula attiva uno dei due meccanismi di riparazione seguenti: il meccanismo di giunzione terminale non omologa (Nonhomologous End Joining, NHEJ) o il meccanismo di ricombinazione omologa (Homology-Directed Recombination, HDR). Il meccanismo NHEJ viene comunemente utilizzato per alterare un gene mediante l’inserimento o la delezione di basi (indel), mentre il meccanismo HDR può essere impiegato per il “knock-in” di un gene reporter o di una sequenza modificata mediante lo scambio di sequenze tra due molecole di DNA simili o identiche.